Діагностика Covid-19. Погляд лікарялаборанта
З грудня 2019 року триває спалах коронавірусної хвороби, наслідком якої є пневмонія, спричинена важким гострим респіраторним синдромом коронавірусу (SARS-CoV-2). Інфекція поширена у всьому світі, і кількість інфікованих і надалі зростає.
Отже, існує гостра необхідність у швидких, простих і точних тестах для діагностики важкого гострого респіраторного синдрому коронавірусу 2 (SARS-CoV-2).
Доступні на сьогодні інструменти діагностики SARS-CoV-2 ґрунтуються на
Виявленні антигенів вірусів
a)хроматографічними методами
б) виявленні вірусних антигенів методом ПЛР
Виявленні антитіл людини до коронавірусу
Чутливість тестів на антигени хроматографічним методом, як правило, нижча, ніж у тестів на нуклеїнові кислоти методом ПЛР, хоча їх специфічність порівнянна. Виявлено, що антигенні тести були більш достовірними у дні, коли з’явились симптоми, коли вірусне навантаження в носоглотці вище.
На відміну від ідентифікації нуклеїнових кислот методом ПЛР, якою підтверджується активна інфекція SARS-CoV-2; виявлення антитіл підтверджує минулу інфекцію, навіть у безсимптомних суб’єктів
Полімеразні ланцюгові реакції зворотної транскрипції в реальному часі високочутливі та високо специфічні, можуть виявляти SARS-COV-2, націлюючись на білок оболонки, білок нуклеокапсиду, гени РНК-залежної РНК-полімерази та N1, N2 та N3 гени -мішені. Тому полімеразні ланцюгові реакції зворотної транскрипції в реальному часі залишаються основним методом діагностики SARS-CoV-2
Тести ПЛР дуже специфічні і ймовірність хибнопозитивних результатів низька, за виключенням виявлення залишкових фрагментів РНК вірусу, що поступово руйнуються в клітинах , але можливі хибнонегативні результати залежно від типу мазка та часу від початку симптомів.
Кілька послідовних негативних результатів тестування зовсім не виключають можливості наявності інфекції.
Хибнонегативні випадки мають важливі наслідки для ізоляції пацієнтів та ризику передачі вірусу від інфікованих
До появи хибнонегативних результатів наводить ряд факторів:
- низька якість зразків;
- зразок був взятий дуже рано або занадто пізно щодо перебігу захворювання;
- при роботі зі зразком або в процесі його транспортування не було дотримано необхідних вимог;
- технічні фактори, пов'язані з виконанням тесту, наприклад мутація вірусу або інгібування ПЛР.
Хибнонегативні результати:
порушення на преаналітичному етапі
Рекомендується використання зразків матеріалу з верхніх дихальних шляхів, наприклад, носоглотки і ротоглотки. Однак, необхідно стежити за тим, щоб носоглоткові мазки бралися не просто з ніздрів, а безпосередньо з носоглотки, щоб для діагностики було взято не слиз, а клітини епітелію. Для взяття мазків з носоглотки і ротоглотки повинні використовуватися призначені для цієї мети зонди, забезпечені пробіркою з транспортним середовищем. По можливості слід брати проби як з верхніх, так і з нижніх дихальних шляхів.
2. Залежить від часу від зараження та початку виникнення симптомів
За результатами досліджень за 4 дні від інфікування до початку симптомів (5-й день) ймовірність хибнонегативного результату у інфікованої людини зменшується зі 100% на 1-й день до 60-70% на 4-й день. У день появи симптомів середній показник хибнонегативних результатів становив 30-40% Цей показник зменшився до 20% на 8 -й день (через 3 дні після початку симптомів), а потім знову почав зростати, з 20 на 9 -й день до 60 на 21 день. (зробити графік)
У середньому тривалість виявлення вірусу була довшою при відборі проб з нижніх дихальних шляхів, ніж верхніх. Тривалість виявлення вірусу у фекаліях та дихальних шляхах у різних хворих дуже різнилася. У деяких вірус все ще можна було виявити через 40 днів після початку симптомів.
Важливо розуміти, як прогностична цінність тесту змінюється залежно від часу від зараження та початку симптомів, щоб уникнути помилкового заспокоєння негативними результатами тесту.
3. Відбір і транспортування зразків для лабораторної діагностики COVID-19.
Рекомендації Всесвітньої Організації Охорони Здоров'я (ВООЗ) для збору і зберігання зразків для лабораторного тестування на COVID-19 представлені в таблиці
|
ТИП ЗРАЗКА
|
ЗБІР МАТЕРІАЛУ
|
ТЕМПЕРАТУРА ЗБЕРІГАННЯ ДО ТЕСТУВАННЯ В ЛАБОРАТОРІЇ
|
РЕКОМЕНДОВАНА ТЕМПЕРАТУРА ЗБЕРІГАННЯ ДО ВІДПРАВЛЕННЯ ВІДПОВІДНО ДО ОЧІКУВАНИМ ЧАСОМ ВІДПРАВЛЕННЯ
|
|
Носоглотковий і ротоглотковий мазок
мокрота
|
Тампони з дакроном і поліестером
|
2 -8 ℃
|
2 -8 ℃ якщо ≤ 5 днів - 70 ℃ (сухий лід) якщо> 5 днів
|
|
Сироватка
цілісна кров
|
Пробірки для відділення сироватки (дорослі: зібрати 3-5 мл, цільна кров)
|
2 -8 ℃
|
2 -8 ℃ якщо ≤ 5 днів - 70 ℃ (сухий лід) якщо> 5 днів
|
|
Кал
Сеча
|
Контейнер для калу
|
2 -8 ℃
|
2 -8 ℃ якщо ≤ 5 днів - 70 ℃ (сухий лід) якщо> 5 днів
|
Технічні фактори – неякісні тест-системи. Некваліфіковані спеціалісти та т. і.
Повідомлялося, що після одужання від COVID-19 деякі з виписаних з лікарень пацієнтів з негативними результатами ПЛР-тесту через деякий час знову мали позитивний результат
Ці спостереження поставили багато нових запитань: чи є коректними ПЛР-тести зразків, узятих з горла (можливо, коронавірус ще наявний у клітинах легень), чи можливе повторне інфікування людини після одужання внаслідок недостатньо потужної імунної відповіді (низького рівня антитіл до вірусу)? Слід зазначити, що випадків зараження від таких пацієнтів не було зафіксовано.
На сьогодні вважають, що принаймні 2–3 негативні результати ПЛР-тесту поспіль можуть свідчити про одужання пацієнта. При цьому раптові позитивні результати не пов’язані з повторним інфікуванням, а пояснюються більш затяжною інфекцією або виявленням залишкових фрагментів РНК вірусу, що поступово руйнуються в клітинах
Основна проблема серологічних тестів для визначення наявності антитіл до вірусу в крові пацієнта є очевидною — перші антитіла (IgM класу) з’являються не відразу, а лише через 5–8 днів після інфікування і поступово зникають, а більш численні і більш специфічні антитіла IgG-класу з’являються ще пізніше, досягаючи максимуму на 24–28-й день, і можуть залишатися в сироватці крові роками
(Наказ МОЗ 12-27 від 20,05,20 рекомендує здати IgM для госпітилізаціі)
Деякі важливі моменти при визначенні нейтралізуючих антитіл до SARS-CoV-2
Чим пояснюються різні значення IgG до SARS-CoV-2 при дослідженні діагностичними системами різних виробників ?
ІФА тест на IgG до Коронавірусу показує, чи є у людини антитіла до Коронавірусу SARS-CoV-2, чи сформувався у нього імунітет.
IgG - це цифровий параметр, у нього є чисельне значення і, відповідно, референтне значення показника, порівняння яких і визначає наявність антитіл і імунітету до COVID-19. Чим значення вище, тим сильніша реакція організму на інфекцію.
Референтні значення IgG ІФА тесту різні в різних діагностичних системах, вони завжди вказуються в результатах тесту.
Різні значення IgG при визначенні антитіл до COVID-19 обумовлені тим, що референтні значення у кожної діагностичної системи відрізняються, оскільки використовуються реактиви та обладнання різних виробників.
Якщо IgG вище референтного значення, вважається що людина має імунітет до короновірусу.
Якщо є необхідність порівняти результати, тоді аналіз проводиться тест-системами одного і того ж виробника.
2. Чому не збігаються результати при постановці діагнозу і проміжні результати під час захворювання?
Антитіла одного і того ж класу (наприклад, G) виробляються на різні ділянки вірусу - антитіла до шипового білка S, антитіла до нуклеопротеїду N, антитіла до матриксу. Всі дослідження зараз зосереджені на 2 істотних різновидах антитіл - до шипового білка S і нуклеопротеїдів N.
Антитіла, що виробляються до шипового білка S є 3 видів: S1 / S2 / RDB (Рецептор зв'язуючий домен). Антитіла до рецептора S білка виробляються у вигляді нейтралізуючих антитіл, які перешкоджають зв'язуванню вірусу з клітинами людини і відразу починають нас захищати . Вони показують рівень індивідуальної протективної (захисної) імунної відповіді до SARS-CoV-2.
Антитіла,що виробляються до нуклеопротеїду N (він розташований всередині вірусу). Організм виробляє достатньо анти-N антитіл. Недавні дослідження показали, що рівень цих антитіл активує клітинний імунітет, який буде захищати нас роками, тобто є маркером перенесеної інфекції.
Різні класи антитіл виробляються по-різному в часі.
Крім того, вони ще й різні навіть у межах одного класу. Наприклад, Ig G для RDM, Ig G для S1 / S2 епітопу і Ig G до нуклеопротеїн N розрізняються.
Тест-системи для діагностики теж відрізняються.
Наприклад, існують
Тест система 1 для виявлення антитіл IgG до повного S білка.
Тест система 2 для виявлення антитіл IgG до S білка (епітоп S1).
Тест система 3: для виявлення антитіл IgG до S білка (епітоп S2).
Тест система 4: для виявлення антитіл IgG до N-білка.
Тест система 5: для виявлення антитіл IgG до N-білку та S-білка.
Наведені вище тест-системи для виявлення антитіл IgG виявляють різні антитіла всередині класу
При лабораторному тестуванні, можливо визначення IgG до різних білків коронавируса. Дуже часто починають порівнювати результати, не враховуючи перераховані вище особливості.
Результати клінічних досліджень свідчать про те, що виявлення антитіл, що зв'язують N -белок, не завжди пов'язано з присутністю нейтралізуючих антитіл до S-RBD. І, навпаки, присутність S-RBD є найкращим індикатором захисту від повторного зараження SARS-CoV-2.
Важливо:
Чому різняться трактування результатів після вакцинації, для діагностики захворювання і протікання захворювання?
Вакцина дає тільки один тип антитіл, а обидва типи мають лише перехворіли.
У кожній тест-системи свої референтні значення, які вказані в результаті аналізу. Не можна переводити з однієї системи в іншу, наприклад, множенням на коефіцієнт і т.д.
Вакцинація та тестування на SARS-CoV-2
Попереднє отримання вакцини проти COVID-19 не впливає на результати ПЛР тестів на віруси SARS-CoV-2.Оскільки вакцини Pfizer-BioNTech, Moderna, Johnson & Johnson, AstraZeneca COVID-19 використовують протеїн-спайк SARS-CoV-2 для генерування імунної відповіді.
Позитивний серологічний (антитіло) тест на протеїн IgM/IgG з шипом може свідчити або про попередню інфекцію, або про щеплення. Щоб оцінити наявність попередньої інфекції у вакцинованої особи, слід використовувати тест на антитіла, який спеціально оцінює IgM/IgG до білка нуклеокапсиду
Сферичні частинки діаметром 120 нм;
Оболонка віріона містить булавоподібні відростки (S-поверховий глікопротеїн, забезпечує проникнення в клітину);
Білки оболонки E (збірка і вихід);
Мембранний білок M (форма віріона);
Нуклеокапсіднийбелок N;
Геном + РНК довжиною приблизно 30000 нт;
РНК містить кепструктуру та полі А послідовність (щоб не розпізнаватися системами внутрішньоклітинного імунної відповіді, які руйнують РНК, що не мають таких структур).
Існують лабораторні тести, які допомагають краще прогнозувати розвиток хвороби
За ці, майже 2 роки пандеміі, вчені встигли багато чого довідатися про новий вірус і тепер лікарі можуть краще прогнозувати розвиток хвороби. В цьому дуже допомагає лабораторна діагностика коронавірусноі інфекціі.
В загальному аналізі крові ми бачимо зміни, характерні для будь-якого вірусного ураження – лейкопенія, лімфопенія, тромбоцитопенія.
Біохімічні дослідження – печінкові, ниркові проби – не дають будь-якоі специфічної інформації, але виявлені відхилення можуть вказувати на наявність органної дисфункції, мають певне прогностичне значення, впливають на вибір лікарських засобів або режим їх дозування
Але є ряд маркерів, які розглядаються як маркери несприятливого прогнозу при коронавірусній інфекції.
Згідно з дослідженням вчених - рівні феритину в сироватці крові, С-реактивного білка, d-димера, лактатдегідрогенази і IL-6 підвищуються при серйозному загостренні, що вказує на високий ризик смерті.
С-реактивний білок – давно використовується як маркер запалення. Найважливіша діагностична перевага С-реактивного білка полягає в тому, що він є дуже раннім маркером запалення, що виникає при інфекції COVID-19: його концентрація підвищується вже через 6-8 годин після зараження.
Визначено, що у 95% пацієнтів, у яких був виявлений коронавірус COVID-19,була значно підвищена концентрація С-реактивного білка (СРБ), як при важкій, так і легкої формах захворювання. Дослідження пацієнтів з COVID-19 показали, що рівні СРБ безпосередньо корелюють із захворюванням: у важкохворих пацієнтів спостерігалося значне підвищення рівня СРБ. Кількісне визначення СРБ може бути достовірним діагностичним маркером важкості, прогресування і результату хвороби.
Феритин в сироватці крові - також добре відомий маркер запалення, характеризує важкість запального процесу.
Феритин - це білок крові, що містить залізо. Аналіз на феритин допомагає зрозуміти, скільки заліза зберігається в нашому організмі.. Достатній рівень заліза в організмі дуже важливий при нормальному стані. Але підвищення рівня феритину в сироватці під час хвороби пов'язане не з кількістю заліза в організмі, а з тим, що процеси пішли не так.
При впливі пошкоджуючого фактора прозапальні цитокіни стимулюють гепатоцити до вироблення декількох захисних білків, один з яких і є феритин. Також при запаленні відбувається посилення секреції феритину макрофагами і вивільнення його з пошкоджених клітин. В результаті відбувається зростання прозапальних факторів в клітинах печінки. Таким чином, феритин і прозапальні цитокіни сприяють розвитку синдрому цитокінового шторму - основна причина смерті пацієнтів.
Інтерлейкін-6 являє собою багатофункціональний білок, який бере участь в регуляції імунної відповіді, реакцій гострої фази і гематопоезу.
Інтерлейкін-6 виробляється лімфоїдними і нелімфоїдними клітинами, а також нормальними і трансформованими клітинами, включаючи T-клітини, B-клітини, моноцити, фібробласти, клітини судинного ендотелію.
Потужний викид цитокінів імунною системою у відповідь на вірусну інфекцію можуть призвести до летальних випадків внаслідок неконтрольованого запалення, яке призводить до поліорганної недостатності, особливо вражаючи серцеву, печінкову і ниркову системи. За попередніми даними можна зробити висновок, що блокування гіперактивації імунітету на рівнях ІЛ-1 і ІЛ- 6 може бути ефективною для лікування хворих з важкою формою коронавируса завдяки пригніченню або запобіганню цитокинового шторму.
D-димер — це білковий фрагмент, що утворюється при розчиненні тромбу, який виникає при згортанні крові.D-димер утворюється в результаті розпаду волокон фібрину.
Але D-димер — не спеціфічний показник венозної тромбоемболії, його підвищення спостерігається при багатьох інших станах, які супроводжуються активацією згортання та розчинення тромбів, тому D-димер ніколи не слід використовувати як єдиний метод виключення тромбозів і будь-який результат теста треба оцінювати у сукупності із клінічними особливостями конкретної людини.
Лактатдегідрогеназа (ЛДГ) - внутрішньоклітинний фермент, який каталізує окислення молочної кислоти в піруват і міститься практично у всіх клітинах організму. ЛДГ найбільш активна в скелетних м'язах, серцевому м'язі, нирках, печінці та еритроцитах. При захворюваннях, що супроводжуються пошкодженням тканин і руйнуванням клітин, активність ЛДГ в крові підвищується. У зв'язку з цим вона є важливим маркером тканинної деструкції. Незважаючи на те, що збільшення активності ферменту не вказує на якусь певну хворобу, його визначення в комплексі з іншими лабораторними аналізами допомагає в діагностиці.
Прокальцитонін (ПКТ) є біомаркером, який широко використується для оцінки ризику виникнення бактеріальної інфекції і подальшого прогресування захворювання.
В ході захворювання, викликаного COVID-19, в ряді випадків, спостерігається підвищення рівня ПКТ. Це може бути викликано двома причинами. Першою є розвиток у пацієнта вторинної бактеріальної ко-інфекції. У пацієнтів з інфекцією COVID-19 відбувається пошкодження вірусом легеневої тканини, яка стає легко проникною для бактеріальної флори (в тому числі і нормальної), що, в свою чергу, призводить до розвитку вторинної бактеріальної пневмонії.
Другою причиною може бути розвиток у пацієнта запального синдрому. Під час цього важкого запалення також відбувається проникнення бактерій через мембрани клітин кишківника і дуже сильна індукція різних цитокінів
Зростання рівня ПКТ є сильним індикатором погіршення стану пацієнта. Цей маркер вважається набагато більш значущим в порівнянні з іншими маркерами запалення, такими як рівень СРБ або рівень лейкоцитів, оскільки останні є неспецифічними маркерами запалення і вже підвищені у більшості пацієнтів через запальні реакції. ПКТ - кращий маркер серед них, тому що він набагато більш специфічний по відношенню саме до бактеріальної інфекції. Однак потрібно пам'ятати про те, що високий рівень ПКТ сам по собі ще не доводить наявність інфекції, треба провести додаткові дослідження, щоб визначити патоген
Очевидно, що інфекція COVID-19 занадто складна, щоб звести її діагностування до якогось одного біомаркерів, не використовуючи інші.
Зміна маркерів крові при коронавірусній інфекціі
Пацієнт А. 58 років. Виявлено РНК COVID-19 методом ПЛР
|
|
Реф. значення
|
27,03,21
|
30,03,21
|
31,03,21
|
1,04,21
|
2,04,21
|
|
Лейкоцити
|
10*9/L
|
4,8
|
5,0
|
4,2
|
8,8
|
10,8
|
|
Лімфоцити
|
%
|
34
|
22
|
15
|
15
|
11
|
|
Моноцити
|
%
|
7
|
6
|
2
|
3
|
8
|
|
Гемоглобін
|
g/L
|
152
|
148
|
157
|
149
|
152
|
|
Тромбоцити
|
10*9/L
|
297
|
191
|
155
|
210
|
231
|
|
ШОЕ
|
Mm/H
|
4
|
6
|
22
|
12
|
12
|
|
СРБ
|
До 5,0 mg/L
|
4,92
|
75,31
|
99,58
|
62,14
|
36,47
|
|
Феритин
|
30-400 ng/mL
|
223
|
1006
|
1241
|
1263
|
975,9
|
|
Прокальцитонін
|
До 0.046 ng/mL
|
0,070
|
0,254
|
0,220
|
0,169
|
0,069
|
|
Д-димер
|
До 0,55 mg/L
|
-
|
0,68
|
0,71
|
0,88
|
2,06
|
Дослідження виконувались на автоматичних аналізаторах:
Sysmex CA-660
Cobas E 411 Roche
Nihon Konden MEK-7222
Goldsite GPP-100
